注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

微量法 100T/96S

測(cè)定意義

維生素 B6（Vitamin B6）又稱(chēng)吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在體內(nèi)以磷酸酯的形式存在，是一種水溶性維生素，在細(xì)胞中參與多種蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝，對(duì)生物體具有極其重要的作用。

測(cè)定原理

VB6 與 4-氨基安替比林在強(qiáng)氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物，在 390nm 有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋、蒸

餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體 70mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 1mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 8mL×1 瓶，4℃避光保存。試劑四：液體 8mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣本處理

1. 組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10  的比例（建議稱(chēng)取約

0.1g，加入 0.6mL 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸餾水 0.4mL，混勻后于

25℃，16000rpm  離心 10min，取上清測(cè)定（動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心

20-30 分鐘）。

2.    細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1  的比例（建議 500萬(wàn)細(xì)胞加入 0.6mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；加蒸餾水 0.4mL，混勻后于 25℃，16000rpm 離心 10min，取上清測(cè)定。

3. 血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作

計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

• 按照蛋白含量計(jì)算

VB6 含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反總÷（V 樣×Cpr）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6 含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ W

1. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6 含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ 細(xì)胞數(shù)量

2. 按照液體體積計(jì)算

VB6 含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反總÷V 樣

= 13.76×（△A - 0.0205）

V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；：V 樣：加入樣本體積，0.04mL；V 樣總：加入提取液體積，

1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g b．用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.1818x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB6 含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反總÷（V 樣×Cpr）

= 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6 含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）

= 27.52×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6 含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）

= 27.52×（△A - 0.0205）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB6 含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反總÷V 樣

=27.52×（△A - 0.0205）

V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；：V 樣：加入樣本體積，0.04mL；V 樣總：加入提取液體積，

1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)

1. 若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過(guò) 1，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 蛋白濃度較高的樣品，比如動(dòng)物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再測(cè)定， 在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。